3: CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE



APPAREILLAGE

Un appareil de chromatographie en phase liquide (figure 3.1) comporte quatre parties : système de pompage, injecteur, colonne et détecteur à travers lesquelles un liquide entraîne les substances d’un mélange à séparer.


Figure 3.1. Schéma d’un appareil à chromatographie en phase liquide.



A. POMPES

Le dégazage de la phase mobile est une opération obligatoire en chromatographie phase liquide. Il se fait par barbotage d’Hélium dans la phase mobile.

Dans le nouvel appareil de chromatographie en phase liquide modèle 1040L de Hewlett-Packard, ce dégazage se fait en plaçant un bout de tube poreux contenant la phase mobile dans une enceinte où on fait le vide. Seuls les gaz peuvent s’échapper par les pores du tube.


Figure 3.2. Module de dégazage sous vide.



Pompes à piston (figures 3.3 et 3.4)

avantages : - à débit constant, faible volume interne et débit continu; - coût modéré à 1 tête; élevé à 2 têtes et plus; - possibilité de gradient d’élution; - sans pulsation à 2 têtes et plus; - permet le dégazage de la phase mobile en tout temps en y faisant barboter du He.

inconvénients : -si une seule tête, pulsations qu’on doit atténuer par des dispositifs appropriés qui sont des amortisseurs de pulsation mais qui introduisent un volume supplémentaire dans le système et augmentent, par conséquent, le temps nécessaire à un changement complet de phase mobile; - entretien difficile.



Figure 3.3. Pompe à piston.




Figure 3.4. Pompe à piston.



B. INJECTEUR

L’injecteur à boucle est le seul dont le fonctionnement sera décrit ici.

Avantages: - permet des injections répétées qui donnent des résultats très reproductibles et donc adaptés aux analyses;
- ne comporte pas de septum;
- peut supporter des pressions qui dépassent 5000 psi.

Désavantages: - la boucle est difficile à remplir ; - la boucle doit être changée si le volume injecté doit être modifié car la boucle possède un volume fixe.



Figure. 3.5. Injecteur à boucle. À gauche, le remplissage de la boucle. À droite, l’injection dans la colonne.


Les injecteurs automatiques sont trop complexes et trop différents les uns des autres pour apparaître dans ce document mais leur principe est le même que celui décrit ci-dessus.





Figure 3.6. Photo d’un injecteur à boucle démonté. Remarquez les canelures de la plus petite pièce qui se superposent aux trous de la plus grande pièce et comparez cette photo à l'injecteur à boucle (figure 3.5)



C. COLONNES


1. Chromatographie d'adsorption - chromatographie liquide -solide et sur résines échangeuses d'ions


Tableau 3.1

Support poreux
support superficiellement poreux
(figure 3.7 a)		 support poreux de faible diamètre (microparticules)
(figure 3.7 b) et figure c)
30-45 mm avec pores peu profonds 1/30 à 1/40 de diamètre d'enveloppe poreuse - silice; - résines échangeuses d'ions. Surface 1 à 25 m2/g diamètre de 20 à 40 mm avec pores profonds - peu efficace diamètre de 5 à 10 mm avec pores peu profonds - surface 200 à 400 m2/g
avantages - transfert de masse rapide (vitesse d'échange élevée);
- ne s'écrase pas sous la pression. désavantage - peu de capacité (faible k') à cause des pores peu profonds, ce qui diminue les possibilités de séparation.		 avantages - permet l'utilisation de colonnes plus courtes et de pressions plus basses; - trajet réduit parcouru entre les particules; - remplissage en mélangeant avec le solvant; - capacité comparable à celle d'un support superficiellement poreux.




Figure 3.7.


Nature des supports

- silica gel comprend ou possède plusieurs types de fonction hydroxyles (figure 3.8) retient fortement les composés basiques comme les amines.

Les hydroxyles libres siloxane
- peuvent provoquer de la chemisorption et par là des effets de queue;
- exigent de longue périodes de récupération. On doit quelquefois ajouter de l'eau pour désactiver ces sites.


Figure 3.8. Structure du silica gel



Tableau 3.2

Support non-poreux
Puisque la surface de contact est beaucoup
moins grande (la moitié) que celle de support poreux,
le diamètre des granules sphériques doit être plus petit,
en fait entre 1 et 2 mm.

Avantages: - conditionnement plus rapide en
l’absence de pores;


- temps de résidence sur la colonne est plus court,
ce qui en fait un avantage dans le cas de séparation de
substances biologiques sensibles;
- plus faible consommation de solvant;
- ne s'écrase pas sous la pression.

Figure 3.9.




2. Chromatographie de partage - chromatographie liquide-liquide

a) sur supports imprégnés de phase stationnaire - peu courants

b) sur phases stationnaires chimiquement liées au support, exemples:


Figure 3.10. Avec phase stationnaire: octadécylsilane


Figure 3.11. Phase stationnaire contenant des fonctions nitriles


Figure 3.12. Phase stationnaire contenant des fonctions amines



c) En phase inversée (reversed phase ou RP) - la plus importante

Elle doit son nom au fait qu’elle est l’inverse d’une chromatographie dite normale. Elle fait référence à une séparation sur une phase non polaire par un solvant très polaire.


la polarité du solvant augmente dans le sens de la flêche
PHASE
NORMALE

adsorbant
polaire et
très polaire
la polarité de
l'échantillon
augmente


Figure 3.13. Interaction entre soluté et solvant en phase normale


la polarité du solvant augmente dans le sens de la flêche
PHASE
INVERSÉE

adsorbant
peu polaire
la polarité de
l'échantillon
augmente


Figure 3.14. Interaction entre soluté et solvant en phase inversée



Le mécanisme de séparation sur colonnes à polarité de phases inversée n'est pas encore bien connu. Plusieurs hypothèses ont été avancées pour l'expliquer. II semble évident que la rétention du soluté est due à son adsorption sur la phase stationnaire sans privilégier l'une ou l'autre des théories qui associent cette phase ou aux chaînes hydrocarbonées ou à une couche du solvant le moins polaire qui se serait accumulé près de la phase stationnaire non polaire. Dans cette dernière hypothèse, il n'y aurait pas contact entre le soluté et la phase stationnaire proprement dite.

La longueur de la chaîne hydrocarbonée n'est pas limitée à 18 carbones; elle peut en contenir 2, 4, 6, 8 et 12. Plus la chaîne est courte, plus la colonne est polaire et inversement.

Avantages

- la possibilité de séparation de solutés de nature non-ionique, ionisable et ionique;
- la séparation des solutés ioniques de ceux qui sont ionisables par création d'équilibres sélectifs tels que le pairage ionique ou l'échange de ligands;
- la détermination de paramètres physicochimiques comme l'hydrophobicité, constantes de formation de complexes et constantes de dissociation;
- séparations rapides et ré-équilibration courtes dues aux faibles énergies de surface de ces phases greffées;
- utilisation d'appareillage simple;
- utilisation de phases liées chimiquement stables et donnant des résultats reproductibles.

Désavantages

- la plage des pH utilisables se situe entre 2 et 7,5 pour des phases stationnaires liées à la silice car à pH>7,5, il y a dissolution de la silice;
- les groupements silanols -Si-O-H retiennent fortement les composés polaires et encore plus les bases donnant des pics avec effets de queue.
- mécanisme de rétention complexe.

Le désavantage provenant de la présence des groupements silanols peut être surmonté par:
- le "endcapping" des silanols par des groupements plus petits - procédé analogue à celui de la silanisation en chromatographie en phase gazeuse. La réaction n’est pas nécessairement complète.



Figure 3.15.


- l’utilisation d’une phase C18 mais dont les substituants sur le Si ne sont plus des groupements méthyles (voir figure 3.10) mais des groupements isopropyles qui masquent les fonctions silanols.


Figure 3.16.


- l'utilisation de bases organiques comme la triéthylamine - mais elles sont difficiles à enlever (cette opération peut demander trois jours de lavage).

Support polymérique

Le développement de supports polymériques a permis de surmonter les difficultés associées à la présence des groupements silanols et aussi à élargir la plage de pH de façon à pouvoir faire des séparations avec une gamme de solvants beaucoup plus étendue.

Support: polystyrène-divinylbenzène (PS-DVB)



Figure 3.17.



D. SOLVANTS

L'équilibre en adsorption est un phénomène de compétition. Les molécules de la phase mobile entrent en compétition avec les molécules de solutés pour les sites polaires d'adsorption (séparation liquide-solide). Plus l'interaction entre la phase mobile et la phase stationnaire est forte moins l'adsorption du produit en solution sera importante et vice-versa. Les solvants sont donc classés selon leur force qui va dans le même sens que leur polarité.


Tableau 3.3

Propriétés de quelques solvants utiles en chromatographie phase liquide
Solvant UV cutoff
(nM)		 Viscosité
(cP)		 Eb
(oC)		 Indice de
miscibilité (M)		 Polarité
(P)
Isooctane 215 0,50 99 29 0,1
Hexane 195 0,31 69 29 0,1
Toluène 284 0,59 111 23 2,4
Méthyl-t-butyléther 210 0,27 55 - 2,5
Dichlorométhane 233 0,44 40 20 3,1
Propanol-1 210 2,30 97 - 4,0
Tétrahydrofurane 212 0,55 66 17 4,0
Chloroforme 245 0,57 61 19 4,1
Éthanol 210 1,08 78 - 4,3
Acétate d'éthyle 256 0,45 77 19 4,4
1,4-Dioxane 215 1,37 101 17 4,8
Acétone 330 0,36 56 15 5,1
Méthanol 205 0,55 65 - 5,1
Acétonitrile 190 0,38 82 11 5,8
Acide acétique - 1,10 118 - 6,0
Eau 190 1,00 100 - 10,20



1. Gradient d'élution

II existe deux modes d'élution:

- isocratique où l'éluant est de composition fixe;

- par gradient où l'éluant est de composition variable. Cet éluant peut provenir d'un mélange de 2 à 4 solvants dont les proportions peuvent changer pendant la séparation. Le changement dans les proportions des solvants peut être linéaire, concave ou convexe et même comporter des régions isocratiques.

En phase normale ils sont utiles pour la séparation de solutés de polarité très différentes. En phase inversée ils servent à la séparation de substances de masses molaires différentes d'une série homologue.



Figure 3.18.


Exemple: mauvaise résolution en début de chromatogramme


Figure 3.19.

Exemple: mauvaise résolution en fin de chromatogramme

Figure 3.20.



2. Chromatographie en phase liquide sur microcolonnes

Analogue à la chromatographie sur colonne en phase gazeuse.

Avantages - économie de solvant;
- produits utilisés en quantité réduite;
- temps de séparation beaucoup plus courts.

Désavantage - exige des solvants et des solutions plus propres car le risque de voir la tuyauterie se bouche reste beaucoup plus grand (diamètre intérieur des tuyaux plus faible).

Les quantités injectées étant beaucoup plus petites, un injecteur split doit être utilisé.


Figure 3.21. Injecteur Valco modifié utilisé pour injection dans les colonnes capillaires en HPLC. Le volume de la boucle est 0,5 mL.


Les microcolonnes sont en silice fondu avec des parois assez épaisses. Ces colonnes ne supportent pas des pressions aussi élevées que les colonnes de métal.



Microcolonne remplie
diamètre intérieur: 50 mM ou moins
Colonne du type ouvert
(open tubular)
diamètre intérieur: 70 mM ou moins
Colonne microbore remplie
d'un granulé enrobé de phase stationnaire
diamètre intérieur: 1000 mM ou moins
Figure 3.22.